Zmniejszona ekspresja TFF2 i zmniejszona glikozylacja αGlcNAc są złośliwymi biomarkerami gruczolaka odźwiernika dwunastnicy.

Pacjenci

W niniejszym badaniu oceniano próbki tkanek od 22 pacjentów ze szpitalem uniwersyteckim Keio z niebrodawkowymi guzami błony śluzowej dwunastnicy i różnicowaniem gruczołu odźwiernikowego. Wszystkie próbki pobrano metodą endoskopowej preparacji podśluzówkowej (ESD) i utrwalono w 10% buforowanej formalinie, a następnie zatopiono w parafinie. Rozpoznanie patologiczne gruczolaka odźwiernika (PGA) przeprowadzono na podstawie skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E), zgodnie z kryteriami klasyfikacji WHO.²³. PGA zostało sklasyfikowane jako niskiej lub wysokiej jakości; Podsumowując, obecność wysokiego stosunku jądro/cytoplazma, wydatnych jąder, licznych mitoz, jąder sięgających do światła i/lub utraty polarności jądrowej komórek nowotworowych wskazywała na wysoki stopień raka.²⁴. Większość próbek PGA zawiera kontinuum zmian o wysokim i niskim stopniu złośliwości. Przeglądając skrawki barwione H&E, w każdym przypadku do dalszej analizy wybrano najbardziej oczywiste zmiany o niskim i/lub wysokim stopniu złośliwości. Charakterystykę kliniczną 22 przypadków PGA przedstawiono w Tabeli 1.

Immunohistochemia

Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono przy użyciu automatycznego barwienia Bond-MAX (Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy). Przed barwieniem immunologicznym pobierano antygen w 10 mM buforze Tris-HCl (pH 9,0) zawierającym 1 mM EDTA. Pierwotnymi przeciwciałami stosowanymi do immunohistochemii były anty-αGlcNAc (klon HIK1083, mysie IgM, Kantokagaku, Tokio, Japonia) rozcieńczone 1/100, anty-MUC2 (klon Ccp58, mysie IgG, Novocastra, Newcastle, Wielka Brytania) rozcieńczone 1/200. -MUC2 (klon Ccp58, mysie IgG, Novocastra, Newcastle, Wielka Brytania) rozcieńczone 1/200, anty-MUC2 (klon HIK1083, mysie IgM, Kantokagaku, Tokio, Japonia) rozcieńczone 1/100, anty-MUC2 (klon Ccp58, mysie IgG , Novocastra, Newcastle, UK) rozcieńczone 1/200, anty-MUC2 (klon Ccp58, mysie IgG, Novocastra, Newcastle, UK) rozcieńczone 1/200, anty-MUC2. -MUC5AC (klon CLH2, mysie IgG, Novocastra) rozcieńczone 1/100, anty-MUC6 (klon CLH5, mysie IgG, Novocastra) rozcieńczone 1/200, anty-TFF2 (klon 2A10, Novus Biologicals, Centennial, CO, USA) 1 /2. /200, anty-p53 (klon DO-7, mysie IgG, DAKO) rozcieńczone 1/2000, anty-MIST-1 (klon D7N4B, królicze IgG; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) rozcieńczone 1/ 100, anty-pepsynogen-1 (klon 8003 (99/12), mysie IgG; Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, USA) rozcieńczone 1/100 i anty-H⁺/K⁺-ATPaza (klon 1H9, mysie IgG; MBL, Nagoya, Japonia) rozcieńczona 1/100. Doświadczenia z kontrolą ujemną przeprowadzono poprzez pominięcie przeciwciała pierwszorzędowego w procedurze immunoprecypitacji i nie stwierdzono żadnego specyficznego barwienia.

Przeprowadzono podwójną immunohistochemię z anty-TFF2 i anty-αGlcNAc przy użyciu automatycznego urządzenia do barwienia Bond-MAX. TFF2 wykryto za pomocą systemu opartego na peroksydazie chrzanowej DAB (ImmPress; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA), a αGlcNAc wykryto za pomocą Fast Red, systemu opartego na fosfatazie alkalicznej (N-Histofine Simple Stain, Nichirei Bioscience, Tokio) . . , Japonia).

Półkwantyfikacja podstawowego białka miozyny, αGlcNAc, TFF2, MIST-1, pepsonigenu-1 i H⁺/K⁺-Wyrażenie ATPazy

Ocenę ekspresji białek rdzeniowych mucyny, αGlcNAc i TFF2 przeprowadzono w oparciu o stosunek dodatnio wybarwionych komórek nowotworowych do całkowitej liczby komórek nowotworowych w każdej zmianie PGA o niskim lub wysokim stopniu złośliwości, a następnie sklasyfikowano w skali od 0 do 3, gdzie 0 oznacza <10% komórek nowotworowych.; 1 reprezentuje 11-33% komórek nowotworowych; 2 reprezentuje 33-66% komórek nowotworowych; a 3 reprezentuje ponad 66% komórek nowotworowych, jak opisano wcześniej^14,15,16. Następnie obliczono stosunek αGlcNAc lub TFF2 do MUC6 dla wszystkich 40 zmian.

Wyniki barwienia p53 sklasyfikowano jako rozproszone, dzikie i utratę ekspresji. Wzorzec typu dzikiego charakteryzuje się słabą, niejednorodną ekspresją.

MIST-1, pepsynogen-1 i H⁺/K⁺-Ekspresję ATPazy oceniano na podstawie stosunku dodatnio wybarwionych komórek nowotworowych do całkowitej liczby komórek nowotworowych we wszystkich zmianach PGA, w tym małych i wysokich, a następnie oceniano od 0 do 3, jak opisano wcześniej.^14,15,16.

Statystyka

Półilościowe wyniki ekspresji dla każdego markera mucyny MUC5AC, MUC6, αGlcNAc i TFF2 analizowano statystycznie przy użyciu testu dopasowanych części Wilcoxona. Analizowano także różnicę w stosunkach stopnia ekspresji TFF2 lub αGlcNAc do MUC6 pomiędzy zmianami PGA o wysokim i niskim stopniu złośliwości. S Za istotne statystycznie uznano wartości <0,05. Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu programu Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA). Wykresy skrzypiec wygenerowano przy użyciu oprogramowania JMP (JMP Statistical Discovery LLC, Cary, NC, USA).

Zatwierdzenie etyczne

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i uzyskało zgodę komisji etycznych Keio University School of Medicine w Tokio, Japonia (nr 20180074). Od wszystkich pacjentów uzyskano pisemną świadomą zgodę.